Ispis

Validacija analitičkih metoda – praktični aspekt

Kreirano Ponedjeljak, 15 Rujan 2014 08:37
Hitovi: 15256

valmU suradnji s HMD-om objavljujemo članak naziva "Validacija analitičkih metoda – praktični aspekt" iz časopisa Svijet po mjeri (godina 2, broj 2, travanj 2013.) čiji je autor mr. sc. Tomislav Madić.

Ovdje će biti dan prikaz prakse unutar farmaceutske industrije kao jedne od najstrože reguliranih u tom području. Opisana će biti validacija metoda tekućinske kromatografije jer se one najčešće upotrebljavaju, u prvome redu za praćenje sadržaja i onečišćenja aktivnih komponenti u farmaceutskim dozirnim oblicima. Validaciju analitičkih metoda zahtijevaju razne državne regulatorne agencije i industrijski odbori. Tako američka Agencija za lijekove i hranu FDA zahtijeva da analitičke metode budu validirane, pri čemu je potrebno pokazati i dokumentirati njihovu točnost, osjetljivost, specifičnost i ponovljivost. Ujedno daju i vodič za kvalitetnu i uspješnu validaciju. Slično zahtijeva i Europska agencija za medicinu EMEA koja se u svojim smjernicama u potpunosti uskladila s prijedlozima ICH-a (International conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use), međunarodnom inicijativom predstavnika regulatornih agencija i farmaceutske industrije Europe, SAD-a i Japana u cilju osiguranja sigurnih, kvalitetnih i efikasnih medicinskih proizvoda.

Analitičke metode trebaju se validirati, verificirati ili revalidirati u sljedećim slučajevima:
• prije uobičajenog korištenja
• pri prijenosu u drugi laboratorij
• pri promijeni parametara metode koji su izvan izvornoga opsega.

Strategija validacije
Svrha metode i validacijski kriteriji definiraju se na početku samoga procesa i moraju odgovoriti na sljedeća pitanja:
• Kakvi analiti će se detektirati?
• Kakav je matriks uzorka? Postoje li interferirajuće supstancije?
• Koje su očekivane koncentracijske razine i rasponi? Koje su granice detekcije (LOD – „limit of detection“) i kvantifikacije (LOQ – limit of quantification)?
• Koja je očekivana preciznost i točnost?
• Kolika je postojanost metoda? Može li se koristiti slična oprema različitih proizvođača ili je nužan specifičan instrument?
• Koja znanja i vještine pretpostavljeni korisnici moraju imati?
• Koje je specifične regulatorne zahtjeve potrebno zadovoljiti?

Značajke metode trebaju se temeljiti na njezinoj namjeni. Na primjer, ako metoda služi za kvalitativnu analizu tragova, nije potrebno ispitivati linearnost metode u cijelome dinamičkom rasponu instrumenta. U tablici 1. dani su parametri koji se ispituju ovisno o uporabi metode.

val1
Pretpostavimo da imamo razvijenu metodu za koju je poželjno da je jednostavna za uporabu, vremenski kratka, pogodna za analizu velikoga broja uzoraka, optimalne cijene te i maloga utjecaja na okoliš i zdravlje analitičara. Validacija metode treba biti pokazana nizom laboratorijskih eksperimenata koristeći se uzorcima i standardnim supstancijama koji su slični uzorcima koji će se rutinski analizirati.

Koraci validacije uključuju izradu validacijskoga protokola s podrobnim uputama, korak po korak, te:
• definiciju svrhe i opsega korištenja metode
• definiranje parametara izvedbe i njihovih granica prihvatljivosti
• definiranje validacijskih eksperimenata
• definiranje svojstava opreme, kvalitete kemikalija i analitičkih standarda
• izvođenje predvalidacijskih ispitivanja u cilju prilagođavanja granica prihvatljivosti
• izvođenje validacijskih eksperimenata
• definiranje detalja metode za njezinu uobičajenu primjenu
• definiranje parametara i granica testa prikladnosti sustava
• i u konačnici, dokumentiranje validacijskih eksperimenata i izrada validacijskoga izvještaja.

Laboratorijsko posuđe kao i svi potrošni materijali, npr. pipete (kapaljke), kivete, bočice (viali) trebaju biti „A” klase kvalitete prikladni za uporabu u kromatografiji. Isto vrijedi i za kemikalije te otapala. Poželjno je korištenje novih kromatografskih kolona koje zadovoljavaju certifikat proizvođača kolona. Takav pristup osigurava dobivanje ponovljivih kromatografskih slika tijekom same validacije i u daljnjoj rutinskoj analizi te izbjegavanje neugodnih iznenađenja za vrijeme eksperimentalnoga rada. Važno je također da su analitičari upoznati sa samom tehnikom i instrumentacijom jer to omogućava brže rješavanje problema i djelotvorniji rad.

Optimalni redoslijed izvođenja validacijskih eksperimenata ovisi o samoj metodi, no najčešće se sljedeći raspored pokazao korisnim:
1. selektivnost koristeći se standardima poznatih analita – optimizacija separacije i detekcije
2. selektivnost na realnim uzorcima
3. linearnost, limit kvantifikacije, granica detekcije i područje na kojem je metoda djelotvorna
4. ponovljivost retencijskih vremena i površina pikova
5. međupreciznost
6. točnost
7. postojanost i međulaboratorijska preciznost

Neki od navedenih parametara mogu se odrediti iz istoga validacijskog eksperimenta. Na primjer, iz regresijskog pravca mogu se odrediti granice detekcije i kvantifikacije. Po završetku validacije priprema se validacijski izvještaj koji obično sadržava:
• cilj i područje primjene metode
• vrstu analita i matriksa
• sve korištene kemikalije, reagencije, referentne standarde, uzorke te detaljan opis načina njihove pripreme uz navedeno vrijeme valjanosti za analizu
• vrstu i funkciju instrumentacije i njezine tehničke značajke
• detaljan opis izvođenja svakoga validacijskog testa s rezultatima i njihovom evaluacijom u odnosu na postavljene granice prihvatljivosti
• određenu nesigurnost mjerenja
• statistički postupci i detaljan izračun analiziranih vrijednosti
• parametre instrumentalne analize s granicama postojanosti
• reprezentativne grafičke prikaze, kromatograme, spektre i odgovarajuće krivulje umjeravanja
• testove prikladnosti analitičkog sustava
• upute za siguran rad
• kriterije za revalidaciju
• literatura, sažetak i zaključak.

Specifičnost/Selektivnost
Potrebno je pokazati da su analiti od interesa odvojeni od ostalih komponenata uzorka, što se provodi uspoređivanjem odziva otopine analita i smjese svih potencijalnih komponenata uzorka poput placeba, procesnih onečišćenja, sintetskih prekursora, razgradnih produkata itd. U tu svrhu uzorak se i umjetno potiče na raspad izlaganjem temperaturi, UV zračenju, kiselom, lužnatom i oksidirajućem mediju. Dobivene smjese analiziraju se i procjenjuje se njihova rezolucija prema najbližemu piku, a ujedno se procjenjuje čistoća pika analita usporedbom UV spektara sa spektrima standarda te testom spektralne homogenosti pika (slika 1. i 2.). Navedeni testovi dio su opcija modernih kromatografskih softvera.

val2

val3

Primjer kriterija prihvatljivosti npr. za metodu određivanja sadržaja minimalna je rezolucija između pika analita i svih
ostalih pikova u smjesi vrijednosti 1,5. Ako to nije ostvarivo, pik koji interferira s pikom analita ne smije u najvećoj očekivanoj vrijednosti prelaziti 0,5 % veličine pika analita. Selektivnost je najizazovnije ostvariti, no ono je ključno svojstvo metode koje ako ne zadovoljava, zahtijeva ponovnu optimizaciju kromatografskih parametara (sastav mobilne otopine, vrsta kolone itd.) odnosno razvoj metode.

Linearnost
Test linearnosti potvrđuje da su otopine uzorka u koncentracijskom području u kojemu je odgovor detektora linearno proporcionalan koncentraciji. Test se obično provodi na pet koncentracijskih razina u željenome radnom području metode (za određivanje sadržaja 80 % – 120 % ciljne koncentracije, onečišćenja LOQ –150 % od granice specifikacije). Linearnost se vizualno dokazuje grafičkim prikazom koncentracije prema odazivu detektora, a evaluira koeficijentom korelacije (za određivanje sadržaja k > 0,997, onečišćenja k > 0,99). Puno je bolji parametar za evaluaciju, postotak odsječka dan relativno prema radnoj koncentraciji koji za analize sadržaja aktivne komponente mora biti ispod 2 % i/ili omjer odziva detektora i koncentracije analita (Response factor) čije slaganje u svakoj točki mjerenja mora biti unutar 2 % prema omjeru na razini radne koncentracije.

Današnji UV detektori imaju širok raspon linearnosti, sve do 1,0 AU (apsorbancijske jedinice) i u tom području potrebno je prilagoditi koncentracijski raspon uzorka. Svejedno događa se da metoda ne pokazuje željenu razinu linearnosti. Razlozi mogu biti u samoj pripremi uzorka – vaganju, otapanju, pipetiranju, uporabi kvalitetnoga volumetrijskog posuđa izvan temperature umjeravanja. Kako površina pika ovisi o retencijskom vremenu, često njegova promjena koja može biti prouzročena lošim radom pumpe instrumenta, promjenom sastava mobilne otopine ili minimalnim curenjem mobilne otopine iz sustava doprinosi smanjenju linearnosti. Ako se upotrebljavaju različiti volumeni injektiranja za standardne otopine i otopine uzorka, potrebno je provjeriti i linearnost injektiranja instrumenta. Naime često proizvođači kao test provjere iskazuju koeficijent korelacije regresijskoga pravca koji daje povoljniju sliku linearnosti.

Prema Lambert-Beerovu zakonu svaka supstancija ima specifični molarni apsorpcijski koeficijent, time i drukčiji odziv detektora. Iz omjera nagiba pravaca linearnosti poznatoga onečišćenja i aktivne komponente prema čijem standardu se radi kvantifikacija može se odrediti relativni faktor odziva detektora, koji se koristi kod računa. Relativni faktori odgovora srodnih onečišćenja većinom su oko jedan jer imaju slične kromofore, no može biti i znatnih razlika, koje treba uračunati u testu točnosti i računu metode.

Nastavak članka možete pročitati u časopisu Svijet po mjeri (godina 2, broj 2, travanj 2013.). Više podataka o časopisu Svijet po mjeri možete pronaći na web stranici www.hmd.hr.


Izvor:HMD

Portal Svijet kvalitete koristi kolačiće (cookies) zbog pružanja bolje funkcionalnosti portala. Nastavkom pregleda portala slažete se s korištenjem kolačića. Postavke kolačića možete podesiti u svojem internetskom pregledniku. Više podataka o kolačićima i vašoj privatnosti možete saznati na Privatnost korisnika.

Prihvaćam kolačiće